Anna Agathonos studierte an der Universität für Musik und darstellende Kunst in Wien und war im Anschluss daran zwei Jahre lang Mitglied des Internationalen Opernstudios von Marseille (CNIPAL). Erste Engagements führten sie an die Opern von Marseille, Avignon und Rouen sowie an die Musikfestivals von Aix-en-Provence (Titelrolle in La Cenerentola, 2000) und Pesaro (Melibea in Il Viaggio a Reims, 2002).
Von 2001 bis 2010 war sie festes Ensemblemitglied am Musiktheater im Revier Gelsenkirchen. Nach Anfängen als lyrischer Mezzosopran und der Übernahme von Hauptpartien in zahlreichen deutschen Erstaufführungen von Belcanto-Raritäten (u.a. Bellini Zaira, Donizetti L'assedio di Calais, Meyerbeer Il Crociato in Egitto) vollzog sie ab 2006 allmählich den Fachwechsel zum dramatischen Mezzosopran und sang Partien wie Azucena, Amneris, Ulrica, Carmen, Cassandre (Berlioz Les Troyens), Dalila, Komponist, Auntie, Old Lady (Bernstein Candide), Jezibaba und Ortrud.
Anna Agathonos sang den Jungen Syrer in der Uraufführung von Enjott Schneider's Das Salome-Prinzip und übernahm 2003 die weibliche Hauptrolle in der Uraufführung von Alexander Müllenbachs Oper Die Todesbrücke bei der Ruhrtriennale . Außerdem verkörperte sie die Anna in Isidora Zebeljans Beitrag zur Eichbaumoper, die 2009 an der U-Bahnstation Eichbaum in Mühlheim an der Ruhr uraufgeführt wurde.
Seit 2010 arbeitet Anna Agathonos freiberuflich. Gastengagements führten sie an die Staatsoper Hannover, das Staatstheater Oldenburg, das Gärtnerplatztheater in München, das Staatstheater Nürnberg und an die Theater Erfurt, Bonn, Mönchengladbach und Pforzheim. Außerdem trat sie an der Griechischen Nationaloper in Athen, an der Opera Ireland in Dublin, am Stadttheater Klagenfurt, am Bartók Plus Opernfestival in Miskolc und im Open Air Festival Oper Burg Gars auf.
Die erfahrene Konzertsängerin sang unter anderem Verdis Requiem und Beethovens 9. Sinfonie mit dem Staatsorchester von Thessaloniki, Mahlers 3. Sinfonie mit der Neuen Philharmonie Westfalen und trat mit dem Orchester des Gärtnerplatztheaters in der Philharmonie München mit Beethovens 9. Sinfonie auf.
Am Anfang der Spielzeit 2018/19 ist sie am Gärtnerplatztheater als Gräfin Eberbach in Lortzings Der Wildschütz und als 3. Dame in Mozarts Die Zauberflöte zu erleben.